液壓撞擊傷后神經(jīng)元內(nèi)游離氫的變化及其影響因素

    液壓撞擊傷后神經(jīng)元內(nèi)游離氫的變化及其影響因素張相彤劉恩重劉曉謙蘇君武俏麗戴欽舜] i）的變化，探討尼莫地平（Nim）、D2 氨基戊酸（DAP5）和亞低溫對創(chuàng)傷后神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i變化的影響及機制。方法以BCECF AM為細胞內(nèi)氫離子的熒光指示劑，用激光共聚焦顯微鏡測定液壓撞擊傷時體外培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i的變化。結(jié)果液壓撞擊傷后腦皮質(zhì)神經(jīng)元[ H ] i于傷后于傷后4 h內(nèi)應(yīng)用可降低[ H ] i，而DAP5于傷后10 h之內(nèi)應(yīng)用有效，亞低溫于30 min內(nèi)應(yīng)用可降低細胞內(nèi)[ H ] i的效果優(yōu)于Nim（P 0 .001）。結(jié)論液壓撞擊傷致神經(jīng)元內(nèi)酸中毒， Nim、DAP5和亞低溫均降低細胞內(nèi)] i，但各自作用的有效時間窗不同，揭示對創(chuàng)傷后神經(jīng)元酸中毒應(yīng)注意綜合治療，并選定各自作用的最佳時間窗。

　　作者單位：150001哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（張相彤現(xiàn)在北京市神經(jīng)外科研究所病理生理研究室，100050）腦創(chuàng)傷是當(dāng)今青少年致死致殘的重要原因之一。腦創(chuàng)傷后的神經(jīng)組織損傷除原發(fā)機械損傷外，其所繼發(fā)的病理損害更為引人注目。這些繼發(fā)的病理損害與腦創(chuàng)傷后神經(jīng)生化反應(yīng)密切相關(guān)，其中包括細胞內(nèi)酸中毒。了解創(chuàng)傷后神經(jīng)細胞內(nèi)酸中毒形成機制，對創(chuàng)傷預(yù)后改善有著重要意義。筆者著重研究尼莫地平（Nim）、D 2 氨基戊酸（D AP 5）和亞低溫對創(chuàng)傷后神經(jīng)元細胞內(nèi)[ H ] i的影響，并分析其可能作用機制。

　　材料與方法1.細胞培養(yǎng)：取新生Wistar大鼠104只大腦皮層組織，分散成單細胞懸液，接種于50 ml培養(yǎng)瓶中的預(yù)先洗滌有多聚賴氨酸（美國Sigma公司）的蓋玻片上，送入含體積分?jǐn)?shù)為培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有體積分?jǐn)?shù)為10 的胎牛血清的RPMI1640.經(jīng)8～14 d的原代培養(yǎng)后進行研究。神經(jīng)元烯醇化酶（NSE）免疫組化染色顯示40陽性，膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白（GFAP）免疫組化染色顯示60陽性。

　　2 .液壓撞擊傷實驗：液壓撞擊傷裝置參考Scott等模型，沖擊壓力為2 .5kPa，作用時間為20～30 ms.

　　3 .實驗分組：（1）正常對照組。（2）創(chuàng)傷組：又分為創(chuàng)傷治療，觀察2 h后對細胞內(nèi)[ H ] i的影響。以上各實驗組鼠數(shù)均為8只。

　　4 .神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i的測定：在蓋玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元，經(jīng)磷酸緩沖液（PBS）沖洗3次后，于37℃條件下用小室上，用Insight plusIQ激光共聚焦顯微鏡488 nm氬離子激光激發(fā)，記錄530 640 nm發(fā)射熒光，求二者之比。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出細胞內(nèi)pH值。

　　直接標(biāo)定細胞內(nèi)pH值求標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制高鉀緩沖液，nm）細胞內(nèi)BCECF的激發(fā)熒光比值，求出該比值與pH值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　5 .統(tǒng)計學(xué)處理：結(jié)果采用SAS軟件系統(tǒng)處理，以x±s表示，組間比較采用雙樣本異方差t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。

　　結(jié)果1 .液壓撞擊傷后神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i的變化：與正常對照組相比較，傷后0 .25 h神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i即已逐漸升高，于傷后12 h達高峰，隨后[ H ] i逐漸下] i的變化2 .Nim、D AP 5和亞低溫對液壓撞擊傷后神經(jīng)元內(nèi)[ H ] i變化的影響：Nim治療組于傷后4 h內(nèi)應(yīng)用可抑制細胞內(nèi)[ H以上應(yīng)用則無效（P 0 .05）。D AP 5治療組于傷后4 h內(nèi)應(yīng)用明顯抑制[ H以上則無效（P 0 .05）。亞低溫治療組在傷后0 .5 h內(nèi)可降低[ H細胞內(nèi)[ H見圖2.

　　] i的影響討論酸中毒是顱腦創(chuàng)傷繼發(fā)性病理損害過程的一個重要方面。因此，直接檢測細胞內(nèi)[ H ] i是深入探討腦創(chuàng)傷時神經(jīng)生化變化的重要手段之一。以往的研究主要采用生化分析血漿中乳酸含量或采用微透析技術(shù)監(jiān)測腦組織細胞外液中乳酸含量等方法間接反應(yīng)腦組織酸中毒。筆者采用細胞內(nèi)H熒光探針BCECF AM直接檢測腦液壓撞擊傷后不同時間單個神經(jīng)元胞漿中[ H ] i水平的變化，發(fā)現(xiàn)腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元存在酸中毒。傷后0 .25 h細胞內(nèi)[ H ] i即已升高，并于12 h達高峰，以后逐漸下降，48 h仍維持較高水平。這種腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元胞體[ H ] i升高的原因尚未完全明確，可能與以下兩方面有關(guān)：（1）腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元內(nèi)K大量外流，從而導(dǎo)致細胞膜去極化，而這種去極化又可誘導(dǎo)興奮性氨基酸（EAA）的釋放，而進一步促進K外流，同時Ca內(nèi)流，這樣在離子跨膜異常與EAA釋放之間形成一種惡性循環(huán)。神經(jīng)元為了維持細胞內(nèi)外正常離子平衡，這種異常跨膜離子障礙激活能量依賴性離子泵及刺激ATP水解增加，最終使糖酵解增強，結(jié)果導(dǎo)致乳酸堆積，細胞內(nèi)酸中毒形成。（2）腦創(chuàng)傷后γ氨基丁酸（GABA）釋放可激活Cl通道，從而使HCO外流同時谷氨酸釋放激活N 甲基D 天門氡氨酸（NMDA）受體，從而H內(nèi)流，這樣形成細胞外液短暫堿性化。這種細胞外液短暫堿性化、細胞內(nèi)H升高及膜去極化均可激活Na交換泵。此外，腦創(chuàng)傷后與EAA受體耦聯(lián)的蛋白激酶C（PKC）也可被激活，從而使Na交換泵磷酸化而激活交換泵間接依賴Na泵直接依賴于Na ATP大量消耗，一方面產(chǎn)生H，另一方面刺激無氧糖酵解增強，最終產(chǎn)生乳酸堆積，細胞內(nèi)酸中毒。可見EAA受體的激活和Na泵與Na泵的激活是乳酸堆積的一個重要來源。

　　腦創(chuàng)傷后神經(jīng)元細胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，而尼莫地平特異性阻斷該通道開放，從而減輕跨膜Ca異常分布，進而減少Ca泵對ATP的消耗，最終使H產(chǎn)生減少及糖酵解作用減弱。此] i競爭細胞內(nèi)蛋白結(jié)合位點，內(nèi)流減少從而使[ H ] i減少。本實驗結(jié)果顯示，尼莫地平于創(chuàng)傷后4 h內(nèi)應(yīng)用有效，10 h以上則無效。這說明腦創(chuàng)傷后早期Ca內(nèi)流很可能以電壓依賴性通道為主，而晚期可能以受體依賴性通道激活的NMDA受體數(shù)目減少，從而減少Ca內(nèi)流及K外流，恢復(fù)跨膜離子異常紊亂降低糖酵解，進而減少[ H ] i的升高。筆者采用NMDA受體競爭性拮抗劑D AP 5 ，在創(chuàng)傷后4 h內(nèi)應(yīng)用最佳，4～10 h內(nèi)應(yīng)用效果欠佳， 22 h以上應(yīng)用則無效。這說明EAA釋放主要在傷后10 h內(nèi)，而10 h以上一方面由于EAA釋放減少，另一方面由于其他生化級聯(lián)反應(yīng)（如花生四烯酸等）形成有機酸增多，并且細胞內(nèi)Ca超載、自由基形成、酸中毒等相互影響，最終使創(chuàng)傷后期酸中毒形成不單一局限于EAA受體所介導(dǎo)的離子紊亂這一因素。亞低溫治療保護作用主要通過以下幾方面降低[ H制EAA釋放（2）減少ATP消耗[ 8]，從而一方面減少H生成，另一方面減少刺激糖酵解增強（3）抑制PKC的活性[ 9]，從而使PKC磷酸化G 蛋白受體抑制，進而控制Na內(nèi)流，減輕跨膜離子紊亂，最終使糖酵解減弱。筆者觀察亞低溫治療組傷后0 .5h內(nèi)應(yīng)用有效，而1 h以上應(yīng)用則無效。其原因可能是傷后1 h以上，EAA釋放增多，而且PKC已被激活，ATP消耗增加，最終導(dǎo)致亞低溫傷后1 h以上應(yīng)用無效。

　　本實驗結(jié)果表明，Nim、D AP 5和亞低溫從不同機制保護創(chuàng)傷后神經(jīng)元，且有效治療時間窗不同。提示臨床上對創(chuàng)傷后神經(jīng)元酸中毒應(yīng)注意綜合治療，并選定各自作用最佳時間窗。本實驗建立于細胞水平的創(chuàng)傷模型，至于整體水平上效果如何，還需要進一步研究。